顕微鏡の生物学的標本の画像化には、従来の顕微鏡では得られない高い解像度が必要です。 主に水で構成され、その後透明になるセルを考えてみましょう。 400〜700ナノメートル（nm）の範囲のほとんどの光は単純に透過するため、可視光ベースの顕微鏡では細胞構造に関する詳細を提供できません。 これにより、従来の顕微鏡を使用して、細胞内構造やタンパク質のようなサブマイクロ・スケールの生物学的単位を観察することが不可能になります。
蛍光イメージングとは、はるかに高い強度の光源と蛍光タグを使用して小規模な生物学的プロセスと構造を視覚化するために明示的に設計された、一連の代替の顕微鏡および分光法を指します。 これにより、生物学的イメージングにおけるコントラストと解像度の問題が解決され、研究者はますます小さなスケールで非常に特定の機能をローカライズできるようになります。 例えば、あるタイプの脳細胞を別のタイプから区別します。 または、細胞内の遺伝物質を検出します。 では、蛍光イメージングはどのように機能するのでしょうか？
蛍光のメカニズム
すべてのタイプの蛍光イメージングは、蛍光のメカニズムを利用して、目的の分子を選択的に励起します。 これは、蛍光標識でタグ付けされた分子が適切な波長の高強度光でプローブされたときに発生します。 基底状態の電子はより高いエネルギー・レベルに遷移しますが、この励起状態は本質的に不安定です。 徐々に、より高い原子軌道の電子はエネルギーを放出し、より低いレベルに戻ります。 このエネルギーは蛍光として観察できます。
蛍光イメージングの種類
最初の蛍光色素が導入される前は、研究者は生体分子サンプルの高コントラスト画像を生成するために明視野顕微鏡法に依存していました。 最新の蛍光イメージング・システムは、根本的に改善された特異性と3D解像度を提供し、ライフ・サイエンスとバイオ・エンジニアリングの全範囲にわたってさまざまなイメージング・システムの大幅な増加をもたらします。 一般的な蛍光イメージング・システムの選択は次のとおりです。
- 蛍光光度
- 蛍光広視野顕微鏡
- 全反射顕微鏡（TIRF）
- 蛍光寿命イメージング顕微鏡（FILM）
- 蛍光共鳴エネルギー移動
- 分子局在顕微鏡
イメージング・システム設定
適切な励起波長で蛍光色素を組み合わせることが、あらゆる蛍光イメージング・システムの成功の中心であり、低ノイズの蛍光シグナルを直接取得できるようにするためのさまざまな方法があります。 蛍光光度計は、200〜750 nmの波長範囲のマルチ・スペクトル光源とモノクロメーターを使用して、微調整された狭い波長帯の光を選択的に透過する場合があります。 これは、回折格子が複数の励起波長を徐々に循環する可能性があるため、1回のスキャンで複数の成分を測定する場合に役立ちます。
特定のフルオロフォアを励起するためのより速くより効率的な方法は、レーザー光を使用することです。 ダイオードおよびダイオード励起ソリッド・ステート（DPSS）レーザーは、はるかに狭い線幅を提供するため、単色性が高くなり、特定の励起波長にはるかに近い蛍光イメージングが可能になります。 さらに、レーザー・ベースの励起により、蛍光イメージングにより、励起信号の微調整に使用される高価なろ過光学系を回避できます。 これには、重量とサイズの節約、効率の向上など、多くの利点があります。